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免疫组化染色过程中存在的五大问题以及解决方案！

时间：2023-03-29 15:06

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一、固定不充分

10%中性福尔马林是目前应用最广泛且效果较好的固定方式。组织块太大，或固定时间太短，都会导致固定不充分。一般8-24h为宜，具体还需要经过实际操作摸索确定。如图1的这种情况，可适当延长固定时间到48h。

图1 固定不充分

二、内源性过氧化物酶

弥散性非特异性背景，可能是由内源性过氧化物酶引起的（如图2）。因此，封闭液要现配现用，充分封闭，一般15min。

图2 内源性过氧化物酶引起非特异背景

三、染料斑点

片子出现染料斑点（如图3），可能是因为染料放置时间太长，可以尝试过滤染料；或者洗涤时不充分，残渣没有洗掉。

图3 染料斑点

四、边缘效应

干片的原因有动作太慢、忘记滴液、滴液流失等，造成非特异性染色，即“边缘效应”（如图4）。采用DAKO笔或PAP Pen在距离组织边缘3-4 mm处画圈，可达到有效的避免液体流失、提高操作速度的效果。

另外，向清洗缓冲液中加入吐温20（Tween-20）也是一种防止干片的好方法。500ml PBS磷酸盐缓冲液，加入2～3滴Tween-20即可。

图4 边缘效应

五、染色不均匀

染色不均匀可能是因为台面倾斜，两边液体不均，液体少的一边，颜色较浅，液体多的一边，颜色较深；也可能是因为抗原修复后，热修复液未冷却，立即取出了片子。

图5 染色不均匀