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制片技术

常规切片的注意事项

常规切片的注意事项:
1.取材
    取材的好坏,直接影响切片的质量。在一个规范的实验室,大部份的切片质量问题都是因为取材不好造成的。医生在取材时,首先要有一把锋利的取材刀,在切割组织时要避免取材刀来回拖拉,切取的组织块厚薄要均匀,一般厚度以0.2 ~0.3cm为适,大块癌组织、脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些;淋巴结应修掉两侧球冠,并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织,如碰到不可避免的钙化组织,应与技术室讲明,在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时,应注意纤维及肌肉的走向,取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。小标本取材时要注意包埋纸的质量,尽可能选择象桃花纸、包茶叶纸等透水性好的纸张,包时不要双层、多层或折叠层数太多,也不要把过多的组织放在一起,影响脱水液的浸透。特别要注意新鲜组织取材,组织容易粘在包埋盒壁上,导致固定、脱水不佳。如果有可能,应选择剖开固定24小时后再取材。
2 . 固定
    固定是技术室工作的第一步,也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”,就是组织离体后,用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败,防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用,使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质,以保持原有的结构和生活时相仿。另外,组织固定后,均呈一定的硬化状态,增加了组织的韧性,而且不易变形,有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定,固定液的量应为组织的5倍以上。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为10%福尔马林(甲醛)。福尔马林渗透性强,固定均匀,组织收缩小,但经酒精脱水后收缩较大。甲醛不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。由于10%福尔马林受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入水分的影响,浓度容易被降低,导致组织固定不足;而高浓度的福尔马林,降低了对组织的穿透性,形成周围固定好而中央固定不到的现象。所以可以适当的增加福尔马林的浓度,以12%左右为佳。
    pH7.0中性缓冲福尔马林对大多数抗原有很好的保存作用,而非中性缓冲福尔马林略差,通过大量实验证明,二者有差异,但并不十分明显,通过对抗原修复液、检测系统和修复方法的不同选择,可以缩小二者的差异。由于HE染色时细胞核的最佳着色点pH为3.5~4.5,中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰。而病理诊断,主要还是以HE切片为主,就常规HE规范化而言,用酸性福尔马林比中性福尔马林要好,每95毫升12%的福尔马林液内加入5毫升的冰醋酸。但从规范和全面角度出发,还是应该使用中性缓冲福尔马林。当然如果根据常规切片、免疫组织化学和分子生物学的需要不同选用二种或二种以上不同的固定液分开制片是最好的解决办法。骨髓应该选择用Bouin液固定24-48小时,如果脱钙不够,可用10%盐酸再脱2-4小时,然后流水冲洗4小时。送检来的大器官应及时切开固定,大标本取材后(2cm厚)固定时间需要6~12个小时,小标本一般需要3~6个小时;当室温低18℃时,应在37℃以下的温箱内加温4~6个小时。
    目前,环保固定液大部份是醇性固定液,对免疫组化结果有一定的影响,乳腺癌诊治规范明确规定不能用醇性固定液,由于我们的诊断标准都是根据10%中性缓冲福尔马林制定的,因此,我们应该慎用。
3. 水洗
    固定后应该水洗(10~20分钟),这一步通常被很多人所忽视,固定后不水洗,容易造成脱片和染色不鲜艳。也不利于蜡块内抗原的长期保存。
4 .脱水
    所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入,这一过程称为脱水。脱水是否彻底,直接关系到组织是否能充分透明。一般我们总认为脱水主要跟高浓度酒精有关,而忽视了与低浓度的酒精关系,其实75-80%浓度的酒精具有极强的穿透力,在短时间内可以置换出大量的水份,而高酒精容易使蛋白质凝固,在组织的表面形成一层硬壳,使酒精难以渗透到组织块中间去,导致组织脱水不佳;其实高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份,如果脱水时加温过高(超过35-50℃),使用丙酮等等,都容易导致组织收缩过度和组织发硬、发脆。组织脱水引起的组织发脆有三种原因:一种是初始脱水液浓度过高引起组织质地发生改变、硬化;第二种是组织本身质地细腻有关,如小动物肝脏;第三种是假脆(也是组织发脆最主要原因),是由于的脱水不足,组织在浸蜡时蜡无法渗透到组织中去,组织在高温下“干烤”导致发硬、发脆,切片会出现粉粉的或一丝丝的现象,子宫肌瘤等较硬的组织还会一棱棱的现象,甚至会整块整块往外崩;严重脱水不足的组织中间发软,甚至还会有水。
    脱水的关键是如何使低浓度的酒精脱水时间和高浓度的酒精脱水时间的正确搭配,低浓度的酒精可以使组织收缩减少,并使组织更好切,高浓度的酒精使组织脱水更彻底。一般情况下,标本脱水时间(35℃)以75%酒精1.5小时,85%酒精2小时、95%酒精(2道大)各1个半小时至2小时、纯酒精(2道)各1个半小时至2小时。小标本脱水时间与大标本差异不大,一般没必要分开,小标本发脆,往往是因为纸包太厚或相互粘在一起,导致组织脱水不彻底引起。如果由于时间关系,也可适当相应缩短。脱水时间长短,与室温高低有密切的相关,同时也与组织的厚薄,组织类型,组织固定的程度等条件都有关。我们在实践中发现,室温在12~15℃时,可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时,组织容易脱水,可适当缩短脱水时间;而室温低于该温度范围时,应适当延长脱水时间。从规范化角度出发,应该尽可能的减少变量,也就是:温度、浓度和作用时间。如果一年四季都在一个恒定的温度下(35℃)最好,有条件的应该买全封闭自动脱水机。更换脱水液,应以量为基础,定量更换。根据我科经验,如试剂用量为500ml,每500个蜡块更换一次为宜。在更换脱水液时,不提倡全部试剂向前退的方法,因为此法不能保证低浓度的酒精的浓度(往往会偏高),所以我们认为85%的酒精不能退到75%的酒精里,95%的酒精不能退到85%的酒精里,无水酒精不能退到95%的酒精里,而第二道的95%的酒精可以退到第一道95%的酒精里,第二道无水酒精也可以退到第一道无水酒精里。由于脱过水的酒精含有大量的脂肪和蛋白质,因此,最好全部更换,要保证各梯度酒精的真正浓度。只有这样才能做好每一批组织。常规切片脱水的原则就是在最短的时间内,使组织脱水彻底,收缩度、硬度适中,切片舒展、好切。在固定充分的情况下,组织在酒精内长时间停留并不会使组织发脆,那怕是无水酒精,那怕是几天。
5.透明
    为了使石蜡能够浸入到组织块内,必须经过一种既能与脱水剂混合,又能与石蜡相溶的媒介物质,这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。

 

很多人认为二甲苯极容易使组织发脆,这个观点并不正确,在固定充分、脱水彻底的情况下,二甲苯并不会引起组织发脆,相反会使某些组织结构比较质韧的组织(比如子宫肌瘤等)由于透明充分而变的更好切。而所谓的发脆,往往是组织浸蜡充分,使组织恢复到其原有的质地,在蜡块冰冻的情况下产生的,如果用冰水或常温切片,就不会有脆的现象。所以二甲苯透明(2道)各30-60分钟,如果有时间,时间可以更长,透明充分,蜡也能浸的更充分。但当组织内有少量水份,二甲苯在高温下将水置换出来,导致组织干烤,可能会导致组织发硬。

 

6.浸蜡

 

    组织透明后,在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。目的为了使石蜡渗透到组织中去。浸蜡温度过高(超过60℃),在蜡内加入二甲苯或由于透明时带入石蜡的二甲苯过多,如果小组织内含有少量水份,会导致小组织发硬,还会使组织内的抗原受到破坏;所以浸蜡用的石蜡熔点应该在54-56℃左右(三道),时间:第一道:石蜡30分钟;第二道:石蜡60分钟;第三道:石蜡,90分钟以上。浸蜡温度控制在56~58℃左右。(第一道也可用硬脂酸石蜡1:3混合浸蜡,不仅可软化组织,特别适用于比较韧、硬的组织,而且由于硬脂酸是弱酸性的,染色后核浆比比较鲜明,缺点是容易脱片,疏松组织在展片时容易散开,所以要用后面几道石蜡尽可能将硬脂酸洗净。所以一般不要使用此法)。用开放式的脱水机最好每天打开第一道石蜡的盖子,让二甲苯挥发掉。浸蜡用的石蜡如有杂质应该过滤,以防吸入组织内,造成切片刀刀口受损,或切片破碎和划痕增多。
7.包埋
    用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整,二是方位。要求在包埋时,应采用镊子轻压组织块拱起部份,使之平贴于底部,通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织,应尽量放在一起,并保证在一个平面上,蜡块上下应留有余蜡。包埋时还应注意有无缝线,纸絮,如有一定要去除。胃黏膜活检标本,不能按一般的规律取最大包埋面,应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤,留有杂质的石蜡,容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56~60℃之间选择,不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块,到了夏天,会粘在一起,不利于资料的保存,而且即使在冬天,用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
8. 磨刀
    要想切好一张切片,首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术,刀磨的好坏,直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同,但都要求用力均匀,使刀口和磨刀石全面接触,两手的用力点应在刀口上,而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次,每次仅需10~15分钟,过长时间的磨刀,容易把已经磨出的锋刃磨掉,检查切片刀是否锋利,用手试摸刀口的方法并不十分科学,不仅不能证明切片刀是否真正锋利,而且容易损害刀口,最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后,应将磨刀石用盖子盖好,以防灰尘掉在磨刀石上,用有灰的磨刀石磨刀,会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机,磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错,但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握,故效果并不理想。根据我们的经验,真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片,必须及时更换刀口。粗切的刀口和切片用的刀口最好分开,这样可以节约刀片,也可提高切片质量。
9. 切片
    切片前要把切片机上有关的螺旋拧紧,并调整好切片刀的角度。切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在15~30微米左右,质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些,粗切致组织全部暴露后,才进行细切。细切至组织块表面均匀一致,无白点后,再把切出的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和,摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均,切片难以展开;过慢会使切片增厚。切片厚度一般为3~5微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致,切片的不完整,常会将重要病变遗漏,导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时,应注意组织包埋的方向,组织的层次,纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行,较难切的部分应放在上面,如皮肤的表皮,肿块的包膜,胃肠道的浆膜等,这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀,避免用力过重,减少机器的磨损。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口,因为每切到一根笔丝,就会增加一个缺口。切片厚度一般为3~5微米,有人认为:只要切片机刻度标着几个微米,切出来的片子就是几个微米。其实不然,当切片刀不锋利,或切片时速度不匀,或切的较慢时,切的片子都会变厚,只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下,才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法:(1)组织发脆:一般是脱水、透明、浸蜡时间太短、起始浓度过高,在切片时,刀要快,片子要切得薄,蜡块不要太冰,可放在冰水里5-10分钟再切片;也可边切边用嘴向蜡片吹气,可能会好些,也可以在蜡块上涂稀氨水;如果与组织本身质地有关(如小动物肝脏、腺瘤、胃肠粘膜等),蜡块可采用在冰水里浸泡或者说不冰就切,我们不可能做到在冰冻的情况下所有的组织切片都没有裂隙,只有改变我们的切片方法,不要用冰去冰,这就要求我们固定要充分、脱水要彻底。2)切片卷起,可能是刀不锋利,或刀锋在另一面,或刀角度过大,切片太厚等等。(3)蜡片弯曲:可能是刀锋不均,切片刀未磨直,切片刀与蜡块不平行。(4) 厚薄不均:可能是刀、刀座及蜡块未夹紧,组织太硬,或切片机主轴太向前,或切片机已磨损。(5)切片出现裂痕:可能是刀有缺口,石蜡内有杂质,组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(6)切片不连片,切不下片,切片很厚,或者切片后蜡块发白,内陷:组织脱水不佳。补救办法:可先将蜡块溶解,取出组织,放入加热水浴的丙酮内(80℃),30~60分钟,再进行透明浸蜡包埋切片,也许会好一点。
   切片机用完后必须每天清扫干净,并用松节油或白油等把机器的表面和各关节擦拭干净。要想保证机器的精确度和延长机器的寿命,重点在于机器的保养,必须养成一个良好的工作习惯。
10. 展片与捞片
    展片水温应在42℃至55℃之间,这主要和包埋蜡的熔点和蜡内的添加剂有关,水温过高,会引起组织细胞散开,水温过低,切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯,会造成蜡片迅速溶解。而用一次性刀片切的片子,一碰到热水,片子上的皱摺就无法再展开,这有二个方法可以解决:第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气,这样的片子就会非常平整,放到热水里就会自然展开,比较方便快捷,但这样的片子会略微厚一点;第二、在切完片子后,先把切片放入冷水,再将切片移到热水,这样的片子会较薄,皱摺、气泡也少,是一个很好的方法,推荐使用。也有人选择先放入酒精,如浓度过高,容易引起切片破碎,出现裂隙;像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开,故不作推荐。最后捞片时玻片要干净,要选择那些完整、无皱摺的切片,粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
11. 烤片和脱蜡
    烤片,一般在65℃的温箱内烤片0.5~1小时左右,温度过高,会引起切片细胞收缩;时间太短(少于20分钟),容易造成脱片。脱蜡也相当重要,如果脱蜡不干净,切片不易着色或着色不匀,所以,脱蜡用的二甲苯要经常更换,一般用3道二甲苯,每500ml液体,处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时,必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡,或将二甲苯放入温箱内预热(37-60℃左右)脱蜡。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯,至水。
12. 染色
    染色的原理分物理作用和化学作用二种:
物理作用:分毛细现象,吸附作用和吸收作用,还有分子间的作用力。
化学作用:分化学物质的特性基团(酸性、碱性和两性基团)与染料的结合方式(离子键;共价键和氢键)
而染料根据来源可分:
1)、天然染料(胭脂红、地衣红、番红花红、靛青等)
2)、合成染料(亚硝基染料、硝基染料、偶氮染料、重氮盐类、醌亚胺染料、苯甲烷类染料、口山 叮类染料、蒽醌染料、噻唑类染料、喹啉类染料)
3)、无机化合物(硝酸银、氯化金、碘、高锰酸钾等)
根据染料的化学反应可分:
1)、酸性染料:苦味酸,伊红、酸性品红、刚果红等。酸性染料不是指其水溶液一定显酸性,而是指有酸性助色团与碱作用成盐,其水溶液电离出的有色离子为阴离子。
2)、碱性染料:苏木素,中性红,美蓝、甲基绿等。碱性染料不是指其水溶液一定显碱性,而是指有碱性助色团与酸作用成盐,其水溶液电离出的有色离子为阳离子。
3)、中性染料:是酸性染料和碱性染料混合后而成。如瑞氏染色的碱性染料亚甲蓝和酸性染料伊红混合。
苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定,一般为5-15分钟。经水略洗后,用盐酸酒精分化是关键,分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后,可用温水或自来水蓝化,并充分水洗(流水冲洗5分钟以上),以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液(释氨水、肥皂水等)促蓝,尽管蓝化效果很好,但从实践的结果来看,用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存,容易褪色。最后入伊红复染(5-20秒)。HE染色的关键在于深浅适度,对比鲜明,一般有经验的,肉眼就能判断,但偶而也会出现失误,所以用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程,在蓝化结束后,应在显微镜下观察细胞核着色是否合适,核结构是否清晰,胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是:细胞核与细胞浆应蓝红相映,鲜艳美丽;核浆对比明显,核膜及核染色质颗粒清晰可见。
染液的更换也应该量化,苏木素1500张/500ml,依红3000张/500ml(根据配方不同,苏木素和伊红量会有所差异)。

13.  脱水和封片
    切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精,80%酒精1道,95%酒精2道,纯酒精2道,二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水,但也容易使伊红褪色,故脱水时间可短一点,每道1-3分钟,纯酒精每道5-10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性,可在二甲苯前面增加一道正丁醇;石碳酸-二甲苯液也有此效,但石碳酸是弱酸性液体,如不洗净,可引起切片的褪色,不利于切片久存,故不作推荐。切片经二甲苯透明后,用中性树胶封固。为增加切片的透明度,防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点,所以切片应该二甲苯透明后湿封,严禁用温箱烤干或电吹风吹干后封片,这样容易造成细胞收缩。封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片;在天气较潮湿的日子里,不宜一次将多张切片取出待封,以免切片“还潮”,形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体,处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀,封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖,也不能有气泡。但是,也应该从关心技术员的身体健康出发,以人为本,建议有条件的病理科应该购买自动封片机,
    没有条件的在封片时可以使用环保透明剂透明和环保树胶封片,但效果没有二甲苯透明的好。最后,粘贴标签,标签必须贴于玻片左侧,编号书写清楚,最好能打印。

       文章来源:浙江大学医学院附属第一医院病理科--丁伟老师


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时  间:2019-04-22 10:34

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