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石蜡切片问题处理

石蜡切片基本步骤之三 水洗、脱水、透明、浸蜡包埋

四、水洗

1.目的:

洗去渗入组织中的固定液,终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。

2.原则和方法:

固定后的组织块的冲洗,一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗,这样可以使组织中的固定液随时溢出,洗得更干净彻底,有些还需要进行特殊的洗涤。

(1)各种以水配制的固定液如甲醛,都必须用流水冲洗,大块组织一般冲洗24小时,小块组织一般冲洗2—10小时。

(2)固定液为多聚甲醛时,用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中,每60分钟更新洗涤液一次,累计6小时。

(3)固定液为酒精或是酒精混合液,一般不需用水冲洗,其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。

(4)用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织,必须用流水彻底冲洗干净。

(5)经含有苦味酸的固定液固定的组织块,无论其固定液是水溶性还是酒精溶性,都应充分冲洗,水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时,再进入70%的酒精溶液洗涤,酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤,该溶液可以脱掉苦味酸的黄色,但最好从50%酒精开始洗涤。

五、脱水包埋

(一)脱水

1.脱水的目的

组织内的水不能和支持剂混合,所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡,有利于组织的永久保存。

2.脱水剂

(1)乙醇:可作固定剂,又可脱水剂,但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点,因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水,而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精,逐渐取代组织中水分,以保证组织脱水彻底,并避免组织过度收缩和硬化。

(2)丙酮:脱水能力比酒精强,但对组织的收缩更大,在组织学制片中较少使用,多用于病理快速切片,或用于某些组化水解酶的固定。

(3)正丁醇:是较好的脱水兼透明剂,可与酒精及石蜡混合,用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液,再入正丁醇,进行石蜡包埋时,可先用正丁醇和石蜡等量混合液,然后浸入纯石蜡包埋,正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬,可替代二甲苯,是很好的脱水剂,但由于价格较贵,不常使用。

3.步骤

(1)乙醇脱水过程

50%乙醇 6~8小时

75%乙醇 6~8小时

85%乙醇 3~5小时

95%乙醇 1~2小时

95%乙醇 1~2小时

100%乙醇Ⅰ 1小时

100%乙醇Ⅱ 1小时

(2)丙酮脱水

如果是丙酮固定的组织,则不必再经过乙醇,可以用新丙酮更换一次,便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织,均按上述乙醇脱水方法脱水,亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水2~4小时再入二甲苯透明,透明后浸蜡包埋。

(3)正丁醇脱水

组织用正丁醇脱水前,先经50%乙醇脱水,然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。

50%乙醇 6~12小时

50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水 5~8小时

50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水 4~6小时

45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水 3~5小时

25%乙醇+75%正丁醇 2~3小时

25%乙醇+75%正丁醇 1~2小时

15%乙醇+85%正丁醇 1~2小时

5%乙醇+95%正丁醇 1~2小时

100%正丁醇Ⅰ 1小时

100%正丁醇Ⅱ 1小时

4.注意事项:

(1)脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行,不能操之过急。

(2)脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。

(3)组织块在高浓度,特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强,容易造成组织块的过度硬化,使得切片理组织易碎裂。

(4)在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。

(5)每次更换新的脱水剂时(组织块从低浓度到高浓度),都要把组织块放在吸水纸上吸干,装组织块的容器也要控干水分,以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中,影响脱水效果。

(6)脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件

(二)透明

1.透明的目的

置换组织内的脱水剂,为下一步的浸蜡起到桥梁作用;

使组织呈现不同程度的透明状态,有利于光线的透过。

2.透明剂

(1)二甲苯:是现在应用最广的一种透明剂,价格较便宜,不能和水混合,遇水则变成乳白色浑浊,因此必完全脱水后才能使用;易溶于酒精又能溶解石蜡,透明力强;其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆,所以组织不能在其停留过久,透明时间视组织块的大小、性质而定;有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等,不宜用二甲苯透明,因组织过硬不易切片;长时间接触,对粘膜有刺激作用。 

(2)苯:性质与二甲苯相似,对组织收缩也较小,组织也不易变脆,但透明较慢,组织在其内可以滞留12~24小时,但毒性较大。

(3)香柏油:用为透明剂,效果很好,有高度透明作用,能与醇和二甲苯混合,香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小,但透明的速度较慢,3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合,即香柏油不易被石蜡取代,因此经香柏油透明以后,可经过二甲苯短时间媒浸,再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。

3.二甲苯的步骤:两次透明

第一次透明约40分钟

第二次时间不一定,要视透明效果而定

4.注意事项

(1)时间不宜过长,否则组织会变脆;

(2)组织块脱水必彻底。

(三)浸蜡、包埋(石蜡包埋法)

1.浸蜡

(1)浸蜡的目的

置换组织中的透明剂,为包埋做准备。

(2)浸蜡的步骤

在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯,分别编号1(52℃~54℃)、2(52℃~54℃,或54℃~56℃)、3(56℃~58℃),其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡,取透明好的组织块放入软蜡中各1小时,迅速取出放入硬蜡,同样放置1小时。如果时间来及包埋,可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外,第二天继续。

(3)注意事项

温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围,不能超过60℃;浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。

2.包埋

(1)步骤

①准备包埋蜡:一般应用硬蜡(56~58℃或60~62℃)为好,所用的石蜡要求透明无杂质,新的石蜡要反复熔凝,并有一定的粘韧性,可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。

②准备包埋框:可以用金属的,也可以用硬纸摺叠。

③点燃酒精灯,准备好无齿尖镊子,需作标记应先写好标签。

④在金属框中倒入硬蜡,然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中,置好方向。可室温下冷却。

⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结,若表面已凝结形成一层固体状,即可放入冷水中,加速其凝固。

⑥待蜡块完全凝固以后,便可拆卸包埋框架,或拆开纸盒,取出蜡块。

(2)注意事项

①包埋时夹取组织的镊子,用酒精灯随时烧热,以免石蜡凝结后粘附在镊子上,造成蜡块凝固不均匀。 

②包埋操作要迅速,组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。

③包埋后的蜡块应呈均质半透明状,如果出现白色混浊状,一般出现在组织周围或组织的底部,应考虑这样几个方面的问题:a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了,组织进行包埋时,包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂,d.石蜡不纯。

④包埋箱中的温度必须保持恒定。

⑤如包埋得不好,可将蜡块溶化,重新浸蜡和包埋。

⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色。


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时  间:2013-6-28 17:36:47

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