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光学显微制片技术

光学显微标本的制作技术第一步—取材、固定

取材

材料的好坏直接影响到切片的质量,无论取哪一种动植物材料,以下几点是必须注意的:

(1)植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分;动物材料取用时常对动物施以麻醉,常用的麻醉剂有氯仿和乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。
(2)取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要,应该尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液。
(3)切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤。
(4)切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm,大小不超过5×5mm2。

固定

组织和细胞离开机体后,在一定时间内仍然延续着生命活动,会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态,必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞,阻抑上述变化,并将结构成分转化为不溶性物质,防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外,固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理,还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。
固定剂的作用对象主要是蛋白质,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作时不加考虑,如要观察这些物质,可用特殊的方法将其固定下来。
固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小,都依所固定的材料性质而定,同样一种固定液对某一材料来说是良好的,但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是:穿透组织的速度快。,能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质,不使组织膨胀或收缩以保持原形,硬化组织的程度适中,增加细胞内含物的折光度,增加媒染和染色能力,具有保存剂作用。 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。
简单固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。
简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有:
Bouin液(70份苦味酸饱和水溶液+25份4%甲醛+5份冰醋酸)、Zenker液(升汞5g+重铬酸钾2.5g+硫酸钠1.0g+5ml冰醋酸+100ml蒸镏水)、Carnoy改良液(3份无水乙醇+1份冰醋酸)等。固定剂的种类甚多,我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。 19
固定时,须注意以下几点:
(1)固定剂应有足够的量,一般为组织块体积的10~15倍。
(2)如所固定的材料外表有不易穿透的物质,可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟,再移入水溶性的固定液。
(3)材料固定后如不立即下沉,可将其中气泡抽出。
(4)固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加控制,不能过长。
(5)一般固定剂都以新配制的为好,用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者,一定要在使用前才混合。
(6)固定完毕,根据所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,影响以后组织块的染色。

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时  间:2013-6-28 15:25:20

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